把上述RNA逆转录合成cDNA文库，逆转录-聚合酶链反应的反应体系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，Total RNA 7 μl，RNase Free 1 μl;反应参数：37 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。

 以上述引物为引物，将逆转录获得的cDNA为模板，扩增目的基因。PCR反应参数：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物EBI3、p35去掉信号肽序列、起始及终止密码子，大小为642 bp及591 bp。

 1.2.3 IL-35-pSectag2A重组真核表达载体的构建 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并照相回收目的片段。将胶回收的产物EBI3及p35连接到T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆于3 ml LB培养基中，37 ℃，120 r/min培养过夜。提取质粒，对EBI3利用HindⅢ、EcoRⅠ进行双酶切，用T4连接酶将酶切的目的片段和同样酶切的pSectag2A载体片段分别进行黏性末端的连接，转化培养 ...... 上一页 第 1 2 页
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