参见附件(12kb)。

  1.2 试剂

 Ki-67兔单克隆抗体、P16鼠单克隆抗体均购于福州迈新生物技术公司，SP试剂盒为Dako公司产品。

 1.3 方法和结果判断

 免疫组织化学按SP法进行染色，具体操作按说明书进行。用AEC显色，光镜下控制显色时间，流水终止反应；常规脱水，水溶性封片。

 Ki-67以细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色。由于正常的鳞状上皮基底层细胞Ki-67呈阳性表达，实验仅观察基底层以上的上皮细胞的阳性率，≥10%为阳性病例。同时按Ki-67阳性率10%～25%、26%～50%、>50% 3个级别进行统计分析。

 P16以细胞质和(或)细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色，P16免疫标记分为阴性、不连续的灶性阳性着色(且阳性细胞≤10%)和连续的弥漫的阳性着色(且阳性细胞>10%)。

 1.4 统计学处理

 观察P16和Ki-67的阳性率和阳性表达方式，比较P16和Ki-67标记结果在高级别VIN与正常组、高级别VIN与低级别VIN组之间的差异，采用SPSS 10.0统计软件包进行处理，行t检验，同时确定P16和Ki-67作为高级别VIN标志物的特异性、敏感性。

 2 结 果

 2.1 P16标记结果

 见表1。

 P16在高级别VIN组中的表达与正常组及低级别VIN组比较，P0.01)。

 图1 低级别VIN组织中P16呈现上皮下1/3不连续的片状胞质或胞核红色着色 SP法×100图2 高级别VIN(VIN Ⅲ)组织中P16呈上皮全层连续的胞质或胞核红色着色 SP法×100

 图3 低级别VIN组织中Ki-67呈上皮下1/3细胞核红色着色 SP法×100

 图4 高级别VIN组织中Ki-67呈上皮全层细胞核红色着色 SP法×100

 2.2 Ki-67的标记结果

 见表2。

 2.3 P16与Ki-67作为高级别VIN标志物的意义

 见表3。

 表2 VIN组织中Ki-67的表达例

 表3 免疫标志物P16、Ki-67在正常组织和不同级别VIN组织中的表达特点

 注：P16阳性表达定义为中1/3和(或)上1/3上皮细胞的弥漫的阳性着色；Ki-67阳性表达定义为下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞核阳性着色

 通过对比高级别VIN组与低级别VIN组的P16、Ki-67标记结果发现，若将P16阳性表达界定为中1/3和(或)上1/3外阴上皮细胞弥漫阳性着色、Ki-67阳性界定为下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞核阳性着色 ......