iCell（赛百慷） 试剂/耗材/技术服务/细胞库 / 细胞培养
已认证 品牌介绍 镜像绮点（上海）细胞技术有限公司（子公司赛百慷）( Cellverse Bioscience Technology Co., Ltd. )是一家专注于研发生产高品质原代细胞、细胞系、干细胞以及相关生物学试剂，并提供专业生物医学技术服务外包的高新技术企业，公司总部位于上海。猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法
人阅读 发布时间：2024-03-28 10:16
骨骼肌细胞是人和动物体内最大的细胞之一，它们是由成肌细胞(Myoblasts)融合而来的多核细胞，故骨骼肌的形成是一个非常复杂的过程，并需要多种细胞信号通路的参与，包括phosphatidylinositol 3-kinase，calcineurin，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌细胞的培养是研究细胞分化过程的有效的模型。
该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。
猪骨骼肌卫星细胞永生化来源于正常动物肌肉组织，通过肌动蛋白（α-actin）免疫荧光染色鉴定为阳性，细胞纯度高于90%。细胞形态位梭形，不规则细胞，贴壁培养。
1.试验所需仪器设备及试剂
（1）仪器
1) 首先将猪颈部动脉放血致死。
2) 小心剪取后肢肌肉，剔除脂肪，筋膜，血管等，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次，
4) 将肌肉组织剪碎，
5) 加入3倍体积的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型胶原酶4℃冰箱过夜消化，
6) 第二天，将混合液取出置于37℃水浴锅中震荡消化1h，
7) 过100目筛网，
8) 收集滤液，
9) 300g 离心5 min，
10) 重悬沉淀，铺瓶
细胞分离培养：
100x 200x
原图见文件-细胞分离培养
3．免疫荧光鉴定
3.1实验步骤
（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
一抗为Myod
3.2免疫荧光鉴定结果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原图见文件-免疫荧光
4.转染
4.1SV40过表达慢病毒基本信息
载体目的序列信息如下：
gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgc
agctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttc
atcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatca
acctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgagg
aaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaa
ggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttaca
ccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataa
catactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaagg
ggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcat
gattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatg
tgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagt
accatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagc
taaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgttt
ggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtat
gactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcag
ctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgacca
gtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaattt
aagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcac
catgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctg
gaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt
gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaat
gtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaag
atggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctca
cagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacag
agcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc
黄色区域为目的序列区
（1）将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，
（2）第二天，待细胞贴壁后，换液，
（3）加入1mL完全培养基，再加20 μL SV40过表达慢病毒，
（4）混匀后继续培养，
（5）12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，
（6）当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。
100x 200x
原图见文件-转染
5.筛选
5.1杀灭曲线的确定
（1）将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，
（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，
（3）将含不同浓度嘌呤霉素（1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，
（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，
（5）每天观察细胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
结果：嘌呤霉素的使用浓度为2μg/mL，作用时间为2d。
5.2嘌呤霉素筛选转染细胞
（1）第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜
（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，
（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的筛选培养基，孵育，
（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，
（5）每天观察细胞的存活比例，
（6）在同一时间点（2d）存活的细胞，即为转染成功的细胞，
（7）对筛选后的细胞进行扩增。
6.细胞扩增
将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为P1代，扩增至少到12代。
100x 200x
