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[摘要]目的 通过丹参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ)对人肝癌细胞(HepG2)的体外实验，研究丹参酮Ⅰ抗肿瘤作用及作用机制。 方法 HepG2细胞培养液中加入不同浓度的丹参酮Ⅰ，培养72h，观察HepG2细胞的增殖率;倒置显微镜观察HepG2细胞的形态变化;流动血细胞计数(FCM)检测HepG2细胞周期及凋亡率;免疫细胞化学检测HepG2细胞的增殖凋亡调控相关基因bax、bcl.2的蛋白表达。 结果 丹参酮Ⅰ抑制HepG2细胞生长，阻滞HepG2细胞周期于G 0 .G 1 期并诱导细胞凋亡;丹参酮Ⅰ通过下调bcl.2基因表达(P1 材料与方法
1.1 材料
丹参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ)购于中国药品生物制品检定所;HepG2细胞由韩国高丽大学肿瘤研究所提供;DMEM细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶(GIB Co);SP免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl.2、bax单克隆抗体(Santa Cruz Co);流式细胞仪和细胞计数仪(Coulter Co);CO2恒温细胞培养箱(Quene Co);Olympus倒置显微镜。
1.2 HepG2细胞培养
HepG2细胞培养于DMEM培养液(含100U·ml -1 青霉素、100μg·ml -1 链霉素、10%小牛血清)，置于37℃、5%CO 2 的恒温培养箱中，每3d换液传代。
1.3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞生长的影响
对数生长期HepG2细胞，接种于直径35mm的培养皿中，细胞浓度约为6.5×10 3 个·ml -1 。随机分为用药组和对照组，用药组分别加入用二甲亚砜溶解的丹参酮Ⅰ(含0.02%二甲亚砜)0.5μg·ml -1 、1μg·ml -1 、1.5μg·ml -1 ，对照组加入0.02%二甲亚砜，每个浓度3个重复培养皿。培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数。设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率:增殖率(%)=[(用药组各时段癌细胞数-用药组开始癌细胞数).(对照组各时段癌细胞数-对照组开始癌细胞数)]×100。
1.4 癌细胞形态学观察
倒置显微镜下动态观察培养皿中HepG2细胞用药前后的变化。
1.5 流动血细胞计数(FCM)检测细胞周期
收集对照组和加丹参酮Ⅰ1μg·ml -1 的用药组培养24、48、72h的HepG2细胞，PBS洗涤后，4℃下用75%酒精固定12h以上;离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg·ml -1 RNA酶溶液150μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶(PI)，300目尼龙网过滤后4℃下放置15min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。
1.6 免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax、bcl.2的蛋白表达
分别收集对照组和加丹参酮Ⅰ1μg·ml -1 的用药组培养48h的HepG2细胞，用S.P法进行染色。小鼠bax单克隆抗体按1∶200稀释，bcl.2单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断:细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数(labeling index，LI)，重复3次，取均值。LI=阳性细胞数.计数细胞总数×100%。
1.7 统计学方法
所有数据资料用SPSS统计软件分析处理，实验数据采用ˉx±s表示，各组间比较用t检验。
2 结果
2.1 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞生长的影响
用药组与对照组相比HepG2细胞数和增殖率减少，均呈浓度和时间依赖性(图1、表1)。
图1 HepG2细胞生长曲线(略)
表1 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞增殖率的影响(略)
2.2 癌细胞形态学观察
在倒置显微镜下见用药组癌细胞数明显减少，细胞变小，折光性差;而对照组的癌细胞形态上无明显改变，生长良好。
2.3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞周期和凋亡率的影响
用药组与对照组比较，细胞周期阻滞在G 0 .G 1 期，并出现细胞凋亡，细胞凋亡率随处理时间和用药浓度增加而上升(表2)。
表2 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞周期及凋亡的影响(略)
2.4 丹参酮Ⅰ对bax、bcl.2蛋白表达的影响
处理48h后，与对照组相比baxLI增加(t=5.66，P3 讨论
本研究对HepG2细胞体外实验结果表明，丹参酮Ⅰ能抑制HepG2细胞的增殖。通过观察HepG2细胞的形态，观察到癌细胞生长被抑制。HepG2细胞周期测定结果显示，与对照组相比用丹参酮Ⅰ处理组G 0 .G1 期和细胞凋亡百分率随处理时间和用药浓度增加而上升，这表明丹参酮Ⅰ能阻滞G 1 期细胞向S期移行，使G1 期细胞数量增多。因此我们推测，当细胞周期被阻滞于G1 期时，在药物的作用下，部分HepG2细胞发生凋亡。bax和bcl.2是一对凋亡相关调控基因， bax主要通过与其家族bcl.2形成二聚体而发生作用。
当bcl.2表达较高时，bcl.2和bax形成异源二聚体而抑制凋亡;当bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡[5] 。本实验结果表明，丹参酮Ⅰ作用于HepG2细胞后bcl.2基因表达减弱，bax基因表达增强，说明其可下调bcl.2、上调bax表达，这可能是丹参酮Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的机制之一。从癌细胞体外实验中可得出丹参酮Ⅰ具有抗肿瘤活性，其作用机制之一是诱导细胞凋亡。
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[5]KORSMEYER S J.Bcl.2gene family and the regulation of pro-grammed cell death[J].Cancer Res，1999，59(7):1693.1700.
[作者简介] 郑国灿(1963-)，男，吉林吉林人，主治医师，医学博士。
(东南大学附属中大医院普通外科，江苏南京 210009;高丽大学肿瘤研究所，汉城韩国 136.701)
http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2004/05/07.htm
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