第1页参见附件(275KB，3页)。
[摘要]目的 研究姜黄素对糖尿病大鼠结缔组织生长因子表达的影响。 方法 24只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和姜黄素治疗组，每组8只，前两组用生理盐水灌胃，治疗组用姜黄素(200mg·kg -1 ·d -1 )灌胃，6周后用半定量逆转录.多聚酶链式反应(RT.PCR)来检测各实验组肾组织中结缔组织生长因子基因的表达水平。 结果 糖尿病组大鼠结缔组织生长因子表达水平与正常对照组比较显著增高(P 1 材料和方法
1.1 实验动物
SD清洁级3月龄大鼠，雄性，体重180～200g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂
姜黄素(Sigma公司产品，纯度99%)，STZ(Sigma公司产品)，尿白蛋白放射免疫分析测定盒(北京北方生物技术研究所)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma公司产品)，Trizol(北京中山生物技术有限公司)，RT.PCR试剂盒及DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)。
1.3 引物
基因序列查自Gene Bank。应用专业引物设计软件Gene Fisher设计而成，由北京赛百盛生物技术有限公司合成。CTGF:上游，5′.GAA AGA CAG GTA CTA GCT GA.3′;下游5′.CGT ACC ATA TGT TCT GAC AG.3′(扩增产物为521bp)。β.actin:上游，5′.TAT CGG ACG CCT GGT TAC.3′;下游:5′.CTG TGC CGT TGA ACT TGC.3′(扩增产物为140bp)。
1.4 方法与步骤
1.4.1 饲养及分组 大鼠饲养于清洁级动物室，饮用水为消毒水，室温21～25℃，光照与黑暗为12h交替。造模前将所有大鼠分为两组:正常对照组(8只)和造模组。造模后选取符合模型标准的大鼠，随机分为糖尿病组(8只)和姜黄素治疗组(8只)。确定造模大鼠达到模型标准后第2天，姜黄素治疗组以姜黄素200mg·kg -1 ·d -1 灌胃，其余两组以生理盐水灌胃。
1.4.2 模型建立及观察 STZ临用前用0.1mol·L -1 、pH4.0的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度，以60mg·kg -1 腹腔注射。造模组72h后检测空腹血糖和尿糖水平，以血糖≥16.7mmol·L -1 且尿糖在+++以上作为模型入选。正常对照组仅予以等量的枸橼酸缓冲液腹腔注射。
1.4.3 标本收集与处理 用药第6周时用代谢笼收集24h尿液，离心，计总量，保存于-30℃冰箱中，以便用放射免疫法检测尿微量白蛋白。第6周末称量大鼠的体重，腹主动脉取血约6ml，用于指标检测。取左肾肾皮质少许装入DEPC浸泡过的EP管中，迅速放入-80℃冰箱中保存，用于测定肾组织中的CTGF mRNA。另取右肾沿正中剖开，置于10%中性福尔马林液中固定，用于病理切片HE染色。
1.4.4 组织总RNA提取及纯度测定 从-80℃冰箱中取出肾组织标本50～100mg，采用Trizol试剂一 步法提取总RNA(具体步骤略)。最后取1μl经稀释后于260nm和280nm测定光密度，计算RNA的含量及A 260 /A 280 比值以确定其纯度，选取A 260 /A 280 大于1.8的RNA样品进行逆转录-多聚酶链式反应(RT.PCR)测定。
1.4.5 RT.PCR反应 根据大连宝生物工程有限公司RT.PCR试剂盒说明进行操作。用2μg总RNA进行RT.PCR反应。CTGF的反应条件为94℃45s，56℃1min，72℃45s，30个循环;β.actin的反应条件为94℃变性5min后，94℃40s，51℃40s，72℃40s，29个循环，终末延伸72℃5min。反应结束后-20℃保存。
1.4.6 RT.PCR产物的电泳分析 取PCR产物10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束，紫外灯下观察照相，对照片进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量，计算出目的基因的相对表达量。目的基因的相对表达量的计算方式为目的基因的密度/β.actin基因的密度。
1.5 统计学方法
数据以x±s表示，数据的比较采用t检验，用SAS统计软件包进行统计分析处理。
2 结果
2.1 各组大鼠的体重变化
与正常对照组比较，糖尿病组大鼠饮水量、进食量、小便量明显增加，每天需换垫料2次，造模后大鼠体重明显减轻;而姜黄素治疗组大鼠饮水量、进食量、小便量较糖尿病组低，每天只换1次垫料即可。喂食6周后各组大鼠体重的比较见表1。
表1 各组大鼠体重变化的比较(略)
2.2 各组大鼠生化指标与尿微量白蛋白排泄率的比较
糖尿病组及姜黄素治疗组大鼠血糖显著高于正常对照组(均为P0.05)。糖尿病组尿微量白蛋白排泄率比正常对照组及姜黄素治疗组均高(均为P 3 讨论
肾纤维化是在各种致病因子如药物、炎症、糖尿病、各种损伤和遗传因素等的作用下，间质细胞及细胞间质增多，尤其是基质蛋白质合成增加、基质降解受抑制造成细胞外基质的大量堆积导致的肾小球硬化和小管间质的纤维化。肾纤维化几乎是所有肾脏疾病发展到终末期肾功能衰竭的共同通路，因而及早阻止甚至逆转肾纤维化对防治终末期肾功能衰竭具有重大意义。糖尿病肾病早期主要的病理特征是肾小球和肾小管肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚及以肾小球系膜区为主的细胞外基质进行性积聚，这些改变最终导致肾脏纤维化和终末期肾病。本实验采用STZ诱导复制糖尿病大鼠模型，从各项实验数据的结果分析模型 复制成功，其早期的肾脏病理变化也符合糖尿病肾病的早期表现。
CTGF是近年来新发现的由349个氨基酸组成、相对分子质量为36000～38000的富含半胱氨基酸的分泌肽 [2] ，属于即刻早期反应基因中的CCN家族成员。它广泛存在于人类多种组织器官中，如心、脑、肾、肝、胎盘、胰腺和结缔组织等，尤其在肾脏中含量最高 [3] 。CTGF对细胞分化、增殖及细胞外基质具有很强的调控作用，其异常表达在肾纤维化发生、发展中起关键作用 [4] 。Wahab等 [5] 用免疫组织化学方法发现正常大鼠在诱导出现糖尿病14d后肾小球中CTGF蛋白表达增加，并随着时间延长CTGF表达进一步增加。最近该作者又发现CTGF能介导TGF.β对人肾系膜细胞的促肥大效应，这可能对早期糖尿病肾病的肾脏病变起重要作用 [6] 。本实验糖尿病大鼠肾组织中CTGF mRNA表达异常增高，与国外报道一致 [7] 。本实验使用姜黄素对糖尿病大鼠治疗6周后，虽然对血糖无明显作用，但能改善其多饮、多食和体重减轻等症状，减少尿微量白蛋白排泄率，减轻肾脏病理变化及肾功能障碍，对糖尿病大鼠早期的肾脏有保护作用。因此我们初步认为姜黄素具有抗肾纤维化的作用，其作用机制可能与姜黄素抑制CTGFmRNA在肾组织的表达有关，其详细机制有待进一步深入研究。
[参考文献]
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[2]BORK P.The modular architecture of a new family of growth regulation related to connective tissue growth factor[J].FEBS Lett，1993，327(2):125.
[3]OEMAR B S，WEMER A，GAMIER J M，et al.Human con-nective tissue growth factor is expressed in advanced atheroscle-rotic lesions[J].Circulation，1997，95(5):831.
[4]MURPHY M，GODSON C，CANNON S，et al.Suppression subtractive hybridization identifies high glucose levels as a stim-ulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial cells[J].J Biol Chem，1999，274(6):5830.5834.
[5]WAHAB N A，YEVDOKIMOVA N，WWSTON B S，et al.Role of connective tissue growth factor in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Biochem J，2001，359(1):77.
[6]WAHAB N A，WESTON B S，ROBET T，et al.Connective tis-sue growth factor and regulation of the mesangial cell cycle:role in cellular hepertrophy[J].J Am Soc Nephrol，2002，13(11):2437.
[7]WANG S，DENICHLO M，BRUBAKER C，et al.Connective tissue growth factor in the tublointerstitial injury of diabetic nephropathy[J].Kidney Int，2001，60(1):96.
[作者简介] 宁勇(1965-)，男，湖北大悟人，主治医师。
(华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科，湖北武汉 430030)
http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2004/02/04.htm
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