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[摘要]目的 检测人endostatin(血管内皮抑制素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞后的表达和分泌情况。方法 电穿孔法将Plncx/endo转染包装细胞PA317，G418筛选阳性克隆后用NII-13T3细胞测定病毒的滴度，RT-PCR法测定耐药的包装细胞中是否存在endostatin基因。取新鲜人脐带血40—80ml，用Ficoll分离出单个核细胞，再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞，流式细胞仪(FCM)检测CD34+造血干细胞的浓度和纯度。将病毒上清与人脐带血CD34’造血干细胞共同培养72h，应用RT-PCR及Westernblot检测人endostatin的表达和分泌。结果 Plncx/en-do质粒克隆扩增后，经酶切鉴定有endostatin基因存在。RT-PCR证实，转染人ermbstatin基因的PA317/endo、NIH3T3/endo细胞中存在人emtostatin特异性片段，病毒滴度为1.3×105cfu·ml-1。FCM检测，CD34+干细胞在脐血中的初始含量8的界面细胞平均可以分离获得(5-20)x1旷CD34+个干细胞。RT-PCR证实，脐带血CD34+/endo造血干细胞基因组中含有人550bpendostatin特异性片段，Westernblot分析显示人en-dostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论 逆转录病毒可以介导endostatin基因转导人脐带血CD34+造血干细胞并表达endostatin蛋白。
[关键词]逆转录病毒；基因；脐带血；造血干细胞；血管内皮抑制素
[中图分类号]R730.5
[文献标识码]A
[文章编号]1671-7562(2005)03—0158-04
http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2005/03/08.htm
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