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[摘要]目的 探讨替米沙坦对肾血管性高血压心肌纤维化及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。 方法 建立二肾一夹肾血管性高血压(2K1C.RH)大鼠模型，将实验大鼠随机分为3组:假手术组、高血压组及替米沙坦治疗组。术后4周末开始以替米沙坦30mg·kg -1 ·d-1 灌胃，共8周。测量大鼠收缩压、胶原容积分数(CVF)、血管周围胶原面积(PV-CA)及CTGF、转化生长因子.β1 (TGF.β1 )的表达。 结果 与假手术组大鼠相比，高血压组的收缩压、CVF及PVCA显著增加(P1 对象与方法
1.1 动物模型及分组
健康雄性Wistar大鼠(由湖北省医科院提供)24只，体重180～220g，随机分为3组(n=8):假手术组、高血压组、替米沙坦组。采用二肾一夹(2K1C)经典造模法[2] 复制肾血管性高血压大鼠模型。用3%戊巴比妥钠(30mg·kg-1 )腹腔注射麻醉，行腹正中切口切开腹壁，游离左肾动脉并用内径为0.2mm银夹钳夹，使左肾动脉部分狭窄，右侧肾动脉不触及。假手术组方法相同，但不安置银夹。术后每2周测血压1次，凡术后4周尾动脉收缩压高于20kPa者确定为高血压形成。替米沙坦组于2K1C术后第4周末开始给予替米沙坦片(勃林格殷格翰国际公司提供)30mg·kg-1 ·d-1 灌胃，连续8周，其余两组给予等量自来水灌胃。给药8周后测量大鼠尾动脉收缩压，处死大鼠进行其它指标的检测。1.2 指标检测
1.2.1 收缩压(SBP)测定
大鼠于40℃预热15min后，用RBP1型大鼠尾压心率测定仪(中日友好临床医学研究所研制)测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压。1.2.2 胶原形态定性及定量分析 取左室中段横截面心肌组织，按常规固定，制片(4μm)后行胶原特异性染色—VG纤维染色。在VG染色下，心肌细胞、红细胞呈黄色，胶原呈红色。采用HPIAS.2000型图像分析系统，测量心肌组织胶原容积积分(CVF)和心肌血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积.总面积，PV-CA=小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。在光镜下，任选取4个视野，以视野中所有胶原面积之和(不包括血管周围胶原面积)除以心肌纤维和结缔组织面积总和，得出CVF。每张心肌切片任选取4个壁内 小动脉，计算PVCA。
1.2.3 CTGF、TGF.β1 免疫组织化学染色方法(SP法) 取石蜡切片常规脱蜡入水，3%H
2 O2 处理20min封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤，微波处理20min，再加10%正常羊血清，置室温20min后加第一抗体(浓缩型兔抗CTGF、TGF.β1 购自博士德生物技术有限公司，工作浓度分别为1∶100和1∶150)，置室温2h并于4℃过夜，PBS洗涤，加生物素标记羊抗兔IgG室温20min，PBS洗后加辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温20min，PBS洗涤，DAB显色液显色，苏木素复染。同时磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组织化学图像分析经标准灰度校正后随机取5个视野(×200倍)，测定阳性细胞的吸光度及面积(μm2 )，以两者乘积表示组织中该抗原相对含量，乘积越大表示抗原含量越高。
1.3 统计学方法
所有数据以ˉx±s表示，采用单因素方差分析和q检验。应用SPSS统计软件进行统计学处理，P 2 结 果
2.1 各组血压及CVF、PVCA值的比较
高血压组的收缩压显著高于假手术组(P3 讨 论
本实验成功构建肾血管性高血压模型，制造高血压靶器官的损害即心肌纤维化，发现CTGF、TGF.β1 蛋白在肾血管性高血压心肌纤维化中异常表达。肾血管性高血压大鼠经替米沙坦治疗后，心肌纤维化减轻的同时心脏内CTGF、TGF.β1 表达也明显下调。心脏纤维化的机制尚未完全阐明，多数学者认为其致病因素是综合性的，循环和局部的神经内分泌因素的作用可能更重要。这些神经内分泌因子包括血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、儿茶酚胺、内皮素、TGF.β1 、CTGF等，其中以AngⅡ对MF的形成影响最大。AngⅡ作为生长因子类促进剂，其促纤维化形成的一个途径就是调节TGF.β1 、CTGF在心血管中的表达 [3，4] 。结缔组织生长因子是新近报道的CCN家族成员之一，为一富含半胱氨酸的具有致纤维化作用的多肽蛋白。生理情况下，机体组织细胞可有基础量CTGF分泌;病理情况下，它与皮肤瘢痕、动脉粥样硬化、器官纤维化、创伤修复等疾病密切相关。Chen等[1] 研究发现急性心肌梗死大鼠在梗死后2～16周左心室中TGF.β1 和CTGF mRNA的表达显著增高，并与纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA水平的伴随升高密切相关。在转基因鼠(拥有人类肾素及血管紧张素原基因)研究中，Piet等[3] 发现CTGF表达水平增高并伴有TGF.β1 、Ⅰ型胶原基因和Ⅲ型胶原基因表达增高。TGF.β1 是CTGF的强诱导剂，在CTGF的启动子157～145核苷酸序列存在一个新的TGF.β1 应答元件，故认为TGF.β1 诱发CTGF表达 增高，TGF.β1 的生物学作用部分由CTGF介导。体外实验发现，CTGF的拮抗剂可抑制TGF.β1 诱导的致纤维化作用[5] ，CTGF现被视为是抗纤维化治疗的新靶点。
AngⅡ可通过促进TGF.β1 表达而间接或直接促进CTGF表达。体外实验发现，使鼠成纤维细胞过度表达的AT1 受体可诱使CTGF表达增高[6] 。AT1 受体是AngⅡ产生心血管作用的靶位，选择性阻断AT1 受体可使肾素血管紧张素系统受到充分抑制。替米沙坦系AT1 受体拮抗剂，肾血管性高血压大鼠经替米沙坦治疗后，心肌纤维化减轻的同时心脏内CTGF表达也明显下调，证实AT1 受体拮抗剂替米沙坦减轻心肌纤维化的效应与降低心肌内CTGF表达有关。其减少CT-GF表达机制可能为:(1)通过选择性地与AT1 受体结合而直接阻断了CTGF增多;(2)通过选择性地与AT1 受体结合阻断了TGF.β1 的表达增多，从而间接影响了CTGF的表达。
[参考文献]
[1]CHEN M，LAM A，ABRAHAM J A，et al.CTGF expression is in-duced by TGF.beta in carbiac fibroblasts and cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis[J].J Mol Cell Cardiol，2000，32:1805.1819.
[2]彭韬，李庆平.粉防己碱对肾性高血压大鼠小血管重构的影响[J].南京医科大学学报，2003，23:8.10.
[3]PIET F，KAIJA I，JUHANI A，et al.connective tissue growth factor gene expression via calcineurin.dependent pathways[J].Am J Pathol，2003，163:355.366.
[4]MONICA R，OSCAR L，LUIS M，etal.Connective tissue growth factor is a mediator of angiotensinⅡ.induced fibrosis[J].Circuca-tion，2003，108:1499.1505.
[5]DUNCAN M R，FRAZIER K S，ABRAMSON S.Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor beta induced col-lagen synthesis;down regulation by camp[J].FASEB，1999，13:1774.1786.
[6]YU J，PRADO G N，TAYLOR L，et al.Global chimeric exchanges within the intracellular face of the bradykinin B2receptor with cor-responding angiotensinⅡtype Ia receptor regions:generation of ful-ly functional hybrids showing characteristic singaling of the AT1a receptor[J].J Cell Biochemistry，2002，85:809.819.
[作者简介] 陈智龙(1975-)，男，湖北黄石人，主治医师，医学硕士。
(1.武汉大学中南医院心内科，湖北武汉 430071;2.武汉大学中南医院病理科，湖北武汉 430071)
http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2005/02/12.htm
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