当前位置: 首页 期刊 《现代医学》 2006年第3期 编号:11039301 阻断胰腺癌细胞膜ｈＥＮＴｓ对氟尿嘧啶细胞毒性的影响 http://www.100md.com 2006年6月1日 高毅明 刘胜利 第1页
 参见附件(322KB，5页)。

  [摘要]

 目的 研究胰腺癌细胞株中核苷载体(NTs)的表达，以及应用潘生丁(dipyridamole，DP)阻断平衡型核苷转运载体(hENTs)后，5氟尿嘧啶(5Fluorouraci，5FU)对胰腺癌细胞株毒性作用的影响。方法 选择胰腺癌细胞株Panc1、Sw1990和Aspc1进行实验。RTPCR法检测细胞株hENT1、hENT2、hCNT1、hCNT2和hCNT3的mRNA表达。根据DP浓度将各细胞株分为4个实验组，即DP空白组，DP浓度为5μmol·L-1组、10μmol·L-1组和40μmol·L-1组,每组细胞分别在含有一定浓度(0～2×108 ng·L-1)的5FU的培养液中培养48h。MTT法检测每组3种细胞株的增殖，并计算各组5FU的半数抑制浓度(IC50)。结果 hENT1的mRNA在Panc1和Sw1990中表达较在Aspc1中高(P [关键词] 细胞毒性；胰腺癌细胞株；核苷转运载体；5氟尿嘧啶；潘生丁

 [中图分类号] R33；R736.7

 The effect of human equilibrative nucleoside transport(hENTs)in pancreatic cancer cell membrane on the cytotoxicity of 5fluorouracil

 GAO Yiming，LIU Shengli(Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009，China)

 Abstract:Objective To investigate subtype expressions of nucleoside transporters in pancreatic cancer cell lines，and the effects of dipyridamole (DP),one of the hENTs blockers，on 5 Fluorouracil (5FU) cytotoxicity to the cell lines. Methods Three pancreatic cancer cell lines(Panc1,Sw 1990,Aspc1) were chosen to detect the mRNA expressions of hENT1，hENT2，hCNT1，hCNT2 and hCNT3 with RTPCR. According to the DP concentration in the study，the cell lines were divided into four groups，the zero DP concentration group，5 μmol·L-1 group，10 μmol·L-1group and 40 μmol·L-1group. The cells in each group were incubated in the medium with a serial concentrations of 5FU from 0 to 2×108ng L-1for 48 h. Then the cell proliferation in each group was measured with MTT assay and the IC50were evaluated. Results The expression of hENT1 was higher in Panc1 and Sw1990 than that in Aspc1(P 1 材料与方法

 1.1 细胞培养与药物准备

 胰腺癌细胞株Panc1和Aspc1由东南大学基础医学院病理学与病理生理学系提供，Sw1990由上海市第一人民医院赠送。Panc1和Sw1990用DMEM培养基，Aspc1用RPMI1640培养基。培养基中含10%灭活小牛血清、青霉素10万U·L-1、链霉素100mg·L-1。细胞在湿度为95%、温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养。

 5FU(批号：0597)、DP(批号： H4159)、二甲基亚砜(DMSO,批号：D5879)等标准品均由美国Sigma公司生产，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司。TRIzol试剂(批号：15596026)购自Invitrogen公司，RTPCR试剂盒(批号：DRR019A)为TaKaRa公司产品。

 5FU用培养液配成储备液(250g·L-1)，由于DP微溶于水，故用培养液和少许DMSO溶解(培养液中DMSO浓度不超过01%)，配成储备液浓度为400μmol·L-1,pH调至72，过滤，4℃保存备用。

 1.2 RTPCR半定量检测细胞株核苷载体mRNA表达

 胰腺癌细胞株总RNA应用TRIzol试剂一步法提取(按Invitrogen公司产品说明进行)，应用凝胶电泳检测RNA的完整性(28s、18s、5s亚基条带清晰，28s与18s荧光强度之比为2∶1，无降解杂带)。测定RNA浓度并调整各细胞株RNA浓度基本一致。根据基因库编码合成引物，其中hENT1引物由上海生物工程有限公司设计,其余核苷载体引物与GarciaManteiga[2]的设计一致，并由上海生物工程有限公司合成。hENT1核苷载体及βactin的引物序列：hENT1(上游5′AGC AGG CAA AGA GGA ATC TGG AGT3′,下游5′GAA GGC AAA GGC AGC CAT GAA GAA3′)；βactin(上游5′CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC3′,下游5′ CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC T3′)。各引物扩增后产物理论长度为：hENT1436bp，hENT2430bp，hCNT1800bp，hCNT2610bp，hCNT3480bp，βactin270bp。

 以1μg各个细胞株RNA为模板，按TaKaRa公司试剂盒所提供的方法进行RTPCR，用βactin作为内参。RTPCR共同反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。仅退火温度不一，其中hENT1与hENT2为55℃,hCNT1与hCNT2为50℃，hCNT3为52℃。反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离(电压100V，时间40min)，ImageMaster VDS扫描分析仪测定各显色带灰度，并计算其与内参的相对比值。上述实验重复3次。

 1.3 MTT法检测不同浓度DP联合5FU的细胞毒性

 将进入对数生长期的细胞接种于两张96孔板中，其中Panc1为4000个·孔-1，Sw1990和Aspc1为5000个·孔-1，待细胞贴壁后进行细胞毒性实验。

 本实验5FU浓度序列为0、1.28×104、6.4×104、3.2×105、1.6×106、8×106、4×107、2×108ng·L-1。根据DP浓度分为4组，即DP空白组，DP浓度为5、10和40μmol·L-1组。为减除背景，每组均另设空白孔和对照孔。每个5FU浓度设3个复孔。按上述分组分别加入含相应浓度药物的培养液培养48h，用MTT法[3]测定细胞生存率，酶标仪570nm处测吸光度(A)值。细胞生存率=(A实验孔-A空白对照)/(A正常对照-A空白对照)。上述实验均重复3次。绘制细胞生长曲线，5FU的半数抑制浓度(IC50)用GraphPad Prism 4 Demo软件(Version 403)计算。

 1.4 统计分析

 各组数据以x-±s表示，组间差异采用单因素方差分析(SPSS 11.5软件)，以P 2 结果

 2.1 胰腺癌细胞株核苷载体的表达水平

 见图1、表1。

 图1 半定量RTPCR检测胰腺癌细胞株hENT1，hENT2，hCNT1，hCNT2，hCNT3的mRNA表达，以βactin为内参(略)

 表1 3种细胞株中各核苷载体与内参βactin的灰度比值(略)

 表1显示，依各核苷载体亚型表达量高低，3个细胞株中Panc1细胞hENT1>hCNT1>hENT2>hCNT2>hCNT3，Sw1990细胞 hENT1>hCNT1>hENT2>hCNT2>hCNT3，Aspc1细胞 hCNT1>hCNT3>hENT1>hCNT2>hENT2。

 同时，hENT1在Panc1中表达量和在Sw1990中表达量相近，差异无统计学意义(P>005)。hENT1在Panc1中和Sw1990中的表达量均较Aspc1中表达量高，分别为Aspc1中的2.3和2.0倍(P005)，但Aspc1中未见表达。hCNT1在Panc1表达较Sw1990和Aspc1高(P005)。hCNT2在3种细胞株中的表达基本相似(P>005)。hCNT3在Aspc1中表达较高，分别为Panc1与Sw1990的1.6和1.3倍(P005)。

 上述结果表明，在Panc1和Sw1990中，hENT1表达量高，hENT2有表达；而在Aspc1中，hENT1低表达，hENT2未见表达；hCNT3在Aspc1中高表达。

 2.2 DP对5FU细胞毒性的增强作用

 见表2。

 表2 不同浓度DP下，3种胰腺癌细胞株5FU的IC50(略)

 实验中发现，DP单独使用对3种细胞株的增殖影响不大，不同浓度DP单独使用对细胞生存率改变的差异无显著意义(P>005)(数据未给出)。

 相比之下，DP与5FU联合应用，在Panc1和Sw1990中却明显增加了5FU的毒性。比较不同浓度DP与5FU联合应用对这两种细胞所产生的细胞毒性时发现,随着DP浓度增加，5FU的IC50逐渐降低。DP空白组、DP 5μmol·L-1组和DP 10μmol·L-1组的5FU的IC50逐渐下降，三者差异有显著性(P005)。这说明DP浓度在0～10μmol·L-1范围内可明显增强5FU对Panc1和Sw1990的毒性作用，DP浓度继续升高对5FU毒性的增强作用不再增加，可能呈现饱和现象。

 然而，DP对Aspc1细胞增强5FU疗效的作用不明显，Aspc1细胞各DP浓度组间5FU的IC50并非随着DP浓度增加而降低(P>005)，组间差异无显著性。

 2.3 核苷载体的表达与5FU的毒性

 DP对5FU毒性的增强作用与肿瘤细胞hENTs表达水平呈平行关系。hENT1在Panc1和Sw1990中高表达，亦见hENT2表达，DP在这两株细胞对5FU毒性的增强作用明显。hENT1在Aspc1中低表达，hENT2无表达，DP在该株细胞对5FU毒性的增强作用不明显。

  3 讨论

 提高细胞内有效药物浓度是增强化疗效果的途径之一。在迄今发现的两类载体中，hENTs在核苷的跨膜转运中起着最重要的作用，其中又以hENT1对核苷转运作用最为突出，转运速度(Vmax)较快，通量最大[4]。hENTs顺浓度梯度转运核苷，系被动转运过程，因此，hENTs对核苷的跨膜转运是双向的。核苷类化疗药物如5FU也是借助细胞膜核苷载体的转运进入肿瘤细胞的[5]，这可能为5FU向细胞内转运的同时也提供了向外返流通道，使肿瘤细胞内5FU难以达到有效浓度。因此，细胞膜hENTs表达量的多少可能影响5FU的细胞毒性作用和临床疗效。然而在本实验中，并未显示这样的结果。虽然3个细胞株中hENTs表达差异较大，如Aspc1细胞中hENT1表达量较低，且hENT2未见表达,但其5FU的IC50却未见比其他细胞株显著增高，即未见hENT1低表达和hENT2未见表达而出现对5FU敏感或耐药现象。在单独5FU的作用下，5FU进出细胞主要以药物的浓度梯度为原动力，直至5FU在细胞内外平衡。因此，本实验细胞中在5FU持续等浓度培养条件下，即使hENTs表达差异较大，也难以显现细胞固有耐药的差异。

 阻断hENTs将可能在阻断5FU向细胞内转运的同时阻断向细胞外返流。此时若仍有其他核苷载体继续将5FU向细胞内单向转运，将可能大大提高细胞内5FU的有效浓度，从而增强5FU的抗癌效果。目前已发现的另一类核苷载体hCNTs为单向向细胞内主动转运的核苷载体，能逆浓度差将核苷向细胞内转运[5]。藉此，阻断hENTs可能不会影响hCNTs对5FU的转运。

 本研究结果显示，在hENTs高表达的Panc1和Sw1990细胞株5FU的细胞毒性增加，在DP 10μmol·L-1组，5FU的IC50分别为DP空白组的1/7和1/10，而在hENT1表达量低、无hENT2表达的Aspc1中，5FU的细胞毒性增加并不明显。这一结果提示，本研究DP对hENTs起到了阻断作用，阻断hENTs能增强核苷类化疗药5FU的抗癌效果，DP对5FU细胞毒性增强作用依赖于肿瘤细胞膜hENTs有无表达和表达量的多少。

 我们以前的研究[1]结果显示，用DP阻断hENTs后可明显增加5FU在肿瘤细胞内药物浓度。阻断hENTs即阻断了5FU向细胞外返流，而此时5FU通过 hCNTs继续向细胞内转运。本研究结果进一步证实了阻断hENTs后5FU在肿瘤细胞内浓度增加，大大增强了5FU的细胞毒性。

 比较5FU的抗癌效果被增强的细胞株(Panc1和Sw1990)的IC50发现，不同DP浓度组5FU的IC50在5μmol·L-1组、10μmol·L-1组逐渐下降(P [参考文献]

 [1]刘胜利,王晶敏,鞠煌先，等.潘生丁抑制平衡型核苷转运蛋白对5氟尿嘧啶在胰腺癌细胞内浓聚的影响[J].中国药科大学学报，2003，34(6):544548.

 [2]GARCIAMANTEIGA J，MOLINAARCAS M，CASADO F J,et al.Nucleoside transporter profiles in human pancreatic cancer cells:role of hCNT1 in 2′,2′difluorodeoxycytidine induced cytotoxicity [J]. Clin Cancer Res,2003,9(13):50005008.

 [3]CHANDLER N M,CANETE J J,CALLERY M P. Caspase3 drives apoptosis in pancreatic cancer cells after treatment with gemcitabine [J]. J Gastrointest Surg，2004,8(8) :10721078.

 [4]MACKEY J R，YAO SYM，SMITH K M，et al. Gemcitabine transport in xenopus oocytes expressing recombinant plasma membrane mammalian nucleoside transporters[J].J Natl Cancer Inst，1999，91(21):18761881.

 [5]KONG W，ENGEL K，WANG J. Mammalian nucleoside transporters[J]. Curr Drug Metab，2004,5(1):6384.

 [6]ACHIWA H，OGURI T,SATO S,et al. Determinants of sensitivity and resistance to gemcitabine:the roles of human equilibrative nucleoside transporter 1 and deoxycytidine kinase in nonsmall cell lung cancer[J].Cancer Sci，2004，95(9 ):753757.

 [7]de TOLEDO R A，CASTILHO M，MAZO L H. Determination of dipyridamole in pharmaceutical preparations using square wave voltammetry [J].J Pharm Biomed Anal，2005,36(5):11131117.

 (东南大学附属中大医院肝胆胰外科,江苏 南京 210009)

 [基金项目] 东南大学913/事业基金资助项目(929001327)
 http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2006/03/03.htm
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