【摘要】 本研究以曲靖市5个不同地理种群的灰尖巴蜗牛为研究对象，采用分子生物学方法，对灰尖巴蜗牛线粒体基因组中的16S rDNA基因进行分离、提取、扩增和测定，以分析DNA序列来探讨该物种整个分布区域的遗传结构；并通过探寻种群间分化水平和系统进化关系，以弄清种群扩散危害路线，为群体遗传多样性分析提供基础数据。研究结果表明，灰尖巴蜗牛5个种群之间存在限制性基因流，种群分化明显，且种群间变异比率高，具有显著的遗传结构；5个种群的历史有效种群大小均比较稳定，没有发生过种群大爆发。该研究数据将有利于针对灰尖巴蜗牛综合防治措施的制定，并有望为其它同类物种的分子生态学研究工作提供重要的参考数据。

 【关键词】 灰尖巴蜗牛；16S rDNA；序列分析；遗传结构

 灰尖巴蜗牛(Bradybaena ravida)，隶属软体动物门，腹足纲，柄眼目，巴蜗牛科，巴蜗牛属，其属陆生贝类软体动物，贝壳壳质坚硬而厚，黄褐色或略呈红褐色，壳体扁球形[1]。该物种喜欢生活于潮湿的灌木丛、草丛中、田埂上、乱石堆中、枯枝落叶下、农田、菜田、庭院以及温室附近的阴湿潮湿、多腐殖质的环境。近年来，保护地农作物的迅速发展为灰尖巴蜗牛的栖息和越冬提供了适宜的环境，致使灰尖巴蜗牛的发生有了加重的趋势。经研究发现，危害农作物的蜗牛主要有3种:灰尖巴蜗牛(Bradybaena ravida)、同型巴蜗牛(B. similaris)、江西巴蜗牛(B. kiangsinensis)。其中以灰尖巴蜗牛的发生数量较多,占55%～65%[2]。
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 1 材料与方法

 1.1 样品采集与保存

 实验用25只灰尖巴蜗牛分别从曲靖师范学院校内4个地点及曲靖市龙潭公园采集，样品去壳后置于95%乙醇中固定保存。

 1.2 总DNA的提取、PCR扩增及序列测定

 1.3 数据分析

 利用软件Chromas、Clustal X 1.8软件进行同源排序，并适当手动校对。 利用DnaSP 4.10.7软件统计序列总变异位点、单突变位点及简约信息位点等。利用Arlequin Ver 3.1软件中的population comparisons和population differentiation两个模块进行分析。基于Kimura 2P模型，计算种群间成对的遗传距离(FST)值。以Arlequin Ver 3.1进行Mismatch分析、Tajima’s序列变异中性检验及Fu’s Fs中性检测。种群的分化和种群结构的地理格局通过Arlequin Ver 3.1分子变异分析AMOVA (Analysis of Molecular Variance)模块来估测。
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 2 结果

 2.1 单倍型分析

 统计分析结果显示，5个地理种群25只灰尖巴蜗牛中分析得到17种单倍型，5个种群单倍型数分别为5，3，3，2，4个，其中第1个种群拥有最多的单倍型数目，第4个种群拥有最少的单倍型数目。

 2.2 种群间遗传分化水平

 种群间的遗传分化程度可通过遗传距离 (FST值)来衡量。分析结果表明，种群间成对的FST值位于0.400-0.900之间，其中Pop4和Pop5两种群间的遗传距离最大，即0.900；Pop3和Pop4两种群间的遗传距离为0.401，是所有值中最小的。

 2.3 种群结构稳定性检验

 采用错配分布分析的结果表明，该物种群体错配分布曲线呈现多峰分布 ，则说明历史种群大小相对较为稳定，即该物种群体遗传结构在历史上是比较稳定的，没有发生过种群大爆发。
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 2.4 群体遗传结构分析

 分子变异分析(AMOVA)结果显示，种群间的变异组分为12.097，占整个变异组分的78.120%；种群内的变异组分为2.259 ，占整个变异组分的14.590%，种群间的变异组分明显高于种群内。上述结果说明种群间的遗传变异对种群结构贡献最大，即灰尖巴蜗牛群体存在着显著的遗传结构。

 3 讨论

 研究结果综合说明，灰尖巴蜗牛群体遗传结构在历史上是比较稳定的，具有显著的遗传分化，种群间遗传距离普遍较高。这种分化格局明显的遗传结构的形成可能主要有以下两方面的原因：首先，遗传分化与灰尖巴蜗牛本身的生物学特征有关。该物种个体小，扩散分布能力有限，种群间存在限制性基因流。这种单个个体迁移距离远小于其分布生境范围的物种，也极易形成距离隔离效应而导致相邻种群间的基因流受限。另外，人类活动影响。本研究采集的5个种群中除Pop5位于龙潭公园外，其余种群均分布于曲靖师院校内，种群内个体的活动可能明显受到人为活动的严重影响，致使各种群出现地理隔离和遗传分化。
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 综上所述，5个不同地理种群间基因交流受限制，种群分化明显，且种群间变异比率高，具有显著的遗传结构，证实了距离隔离对遗传分化具有显著的影响，以及适度人类活动所导致的群体遗传结构稳定，缺乏过种群大爆发。这一重要的结果将有利于针对灰尖巴蜗牛综合防治措施的制定，并有望为该物种的分子生态学研究工作的开展提供重要的参考数据。

 参考文献

 [1] 刘延虹, 陈雯, 谢飞舟.灰巴蜗牛发生规律研究[J]. 陕西农业科学, 2007, 4:126～129.

 [2] 王穿才. 灰巴蜗牛发生规律和习性观察[J]. 中国蔬菜, 2008, 6: 27～29.

 [3] 盛岩,郑蔚虹,裴克全,等. 微卫星标记在种群生物学研究中的应用[J]. 植物生态学报, 2002, 26(增刊):113～119., 百拇医药(查艳景 唐利洲)
 百拇医药网 http://www.100md.com/html/paper/1674-9855/2012/01/131.htm