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王赛群 赵沐子 王云 李建民 王强 南京医科大学基础医学院;南京医科大学附属医院常州第二医院消化内科;
【摘要】目的:构建重组HIV-1相关结合蛋白2(HIV-1rev binding protein2)基因的真核融合表达质粒plenti-GFP-HRB2,用慢病毒表达系统感染HEKTER细胞。对过表达GFP-HRB2基因的细胞在激光共聚焦显微镜下观察,研究HRB2蛋白在细胞中的分布规律。方法:Trizol法提取人睾丸组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物HRB2与克隆载体plp-GFP-C1连接、转化感受态细菌E.coliXLblue。测序正确后将质粒plp-GFP-HRB2与真核表达质粒plenti-C1分别进行双酶切,连接后转化。将构建正确的plenti-GFP-HRB2重组质粒、△8.91、pvsvg瞬时共转染293T细胞后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。收集包装病毒后感染HEKTER细胞。细胞生长一周后,将细胞铺玻片上用激光共聚焦显微镜观察。结果:构建的plenti-GFP-HRB2真核表达质粒经PCR鉴定及测序均说明人源HRB2基因已与plenti-GFP载体正确重组。瞬时转染293T细胞后能观察到绿色荧光。稳定感染后的HEKTER细胞经激光共聚焦显微镜观察后发现,HRB2蛋白在核仁处富集,在细胞核的其它部位少量分布,在胞浆中几乎没有分布。结论:人源HRB2基因表达的相关蛋白具有一个KH结构域,属于KH结构域家族的成员。稳定表达GFP-HRB2融合蛋白的细胞系的成功构建,为深入研究HRB2的入核机制、HRB2蛋白的在细胞分裂、RNA剪切等生物活动中的作用奠定了重要的实验基础。
【关键词】 HRB蛋白 融合蛋白 稳定转染 亚细胞定位
【基金】国家自然科学基金项目(30670790)
【分类号】Q75
前言HRB2(HIV-1revbindingprotein2),又名RIP-1、KRR1p,是一个由381个氨基酸残基组成的蛋白质,其对应基因全长3357bp,有一个长度为1143个氨基酸残基的开放阅读框架。HRB2蛋白在许多物质中都存在相应的同源蛋白,如贾第虫、酵母、非洲爪蟾、小鼠、原鸡、褐鼠和果蝇等。在这组同
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摘要 目的：构建重组HIV-1相关结合蛋白2(HIV-1 rev binding protein 2)基因的真核融合表达质粒plenti-GFP-HRB2，用慢病毒表达系统感染HEKTER细胞。对过表达GFP-HRB2基因的细胞在激光共聚焦显微镜下观察，研究HRB2蛋白在细胞中的分布规律。方法：Trizol法提取人睾丸组织总RNA进行RT-PCR，将纯化的扩增产物HRB2与克隆载体plp-GFP-C1连接、转化感受态细菌E.coli XLblue。测序正确后将质粒plp-GFP-HRB2与真核表达质粒plenti-C1分别进行双酶切，连接后转化。将构建正确的plenti-GFP-HRB2重组质粒、△8.91、pvsvg瞬时共转染293T细胞后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。收集包装病毒后感染HEKTER细胞。细胞生长一周后，将细胞铺玻片上用激光共聚焦显微镜观察。结果：构建的plenti-GFP-HRB2真核表达质粒经PCR鉴定及测序均说明人源HRB2基因已与plenti-GFP载体正确重组。瞬时转染293T细胞后能观察到绿色荧光。稳定感染后的HEKTER细胞经激光共聚焦显微镜观察后发现，HRB2蛋白在核仁处富集，在细胞核的其它部位少量分布，在胞浆中几乎没有分布。结论：人源HRB2基因表达的相关蛋白具有一个KH结构域，属于KH结构域象族的成员。稳定表达GFP-HRB2融合蛋白的细胞系的成功构建，为深入研究HRB2的入核机制、HRB2蛋白的在细胞分裂、RNA剪切等生物活动中的作用奠定了重要的实验基础。
