阿拉丁 化学试剂
已认证 品牌介绍 阿拉丁( Aladdin)是一家领先的高科技企业，生产和销售高纯度特种化学品和生命科学研发用试剂产品，领域涵盖化学、分析化学、生命科学和材料科学等基础创新领域，助力客户的研究计划。同时，我们还通过芯硅谷高端品牌向全球客户提供高端实验室仪器和耗材产品。我们的客户包括大专院校科研院所，以及制药，微电子，化工/石化等行业具商业规模的企业。
蛋白质印迹法是一种利用特异性抗体分离蛋白质的技术，广泛用于分析细胞或组织提取物中的特异性蛋白表达。本实验方案将详细介绍通过化学发光和荧光检测对细胞培养和组织样本进行蛋白质印迹的操作步骤。
免疫测定使用由硝化纤维素或PVDF制成的膜。将凝胶放在膜旁边，然后施加电流，诱导蛋白质从凝胶迁移到膜上。然后用针对目标的特异性抗体进一步处理膜，并使用二抗和其他检测试剂进行可视化。
一、样品准备
制备的裂解物可在上样缓冲液中稀释成几份，并冷冻保存在-80°C下直至准备使用。
• 细胞样本
所需材料
- 样品
- 裂解缓冲液（例如 RIPA R301899）
- PBS
- 蛋白酶抑制剂混合物（例如PMSF溶液P408676）
- 磷酸酶抑制剂混合物（针对磷酸化蛋白-例如P666104）
- 浓缩上样缓冲液
- 二硫苏糖醇 （DTT）
- BCA或Bradford检测试剂盒
实验步骤
1.在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，需要的话再添加磷酸化蛋白质的磷酸酶抑制剂。
注意：整个过程中将样品、缓冲液和设备放在冰上。
2.从培养物中吸出培养基；用1× PBS洗涤细胞；吸出，添加裂解缓冲液悬浮细胞沉淀，一般每107个细胞添加约1 mL裂解缓冲液。4°C摇动孵育10分钟。可以对悬浮液进行超声波处理以打破细胞。
对于悬浮细胞：
用 PBS 清洗细胞两次，方法是旋转（100-500 g，5分钟，4°C）并重新悬浮沉淀。
再次旋转（100-500 g，5分钟，4°C）并在冰冷的裂解缓冲液中重新悬浮。
在洗涤、旋转（100-500 g，5分钟，4°C）和将沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液中之前，可能需要对粘附细胞进行酶促或机械分离。
3.将悬浮液在4°C下以14,000-17,000 g的速度离心5分钟。弃去沉淀，将上清液转移到新管中，置于冰上。
4.使用Bradford或BCA检测法测定裂解物的蛋白质浓度。
提示：如果此阶段的蛋白质浓度较低，并且蛋白质位于细胞核或线粒体中，则可以考虑分馏原始样本以产生更浓缩的裂解物。
5.将裂解物等量分装到几个离心管中。
6.在上样缓冲液中稀释等分试样。添加上样缓冲液以稀释等分试样至总蛋白质浓度约为 1-2 mg/mL。
注意：确保上样缓冲液含有 DTT。
在冰箱中储存之前，用上样缓冲液稀释裂解物可使其更稳定。
7.样品制备完全，可直接用于后续实验，或将样品储存在-80°下直至使用。
• 组织样本
所需材料
- 样品
- 裂解缓冲液（例如 RIPA R301899）
- PBS
- 蛋白酶抑制剂混合物（例如PMSF溶液P408676）
- 磷酸酶抑制剂混合物（针对磷酸化蛋白-例如P666104）
- 装有玻璃珠的管子
- 自动均质机
- 浓缩上样缓冲液
- 二硫苏糖醇（DTT）
- BCA或Bradford检测试剂盒
实验步骤
1.在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，需要的话再添加磷酸化蛋白质的磷酸酶抑制剂。
注意：整个过程中将样品、缓冲液和设备放在冰上。
2.在冰上用干净的工具解剖组织。并将解剖的组织和裂解缓冲液放入装有玻璃珠的管中。一般每200毫克组织片，添加1,200 μL裂解缓冲液。
注意：尽快执行此操作以防止蛋白酶降解。
如果不立即均质化组织样本，则应在液氮中快速冷冻并储存在-80°C下。
3.使用自动均质机裂解组织悬浮液。一般将悬浮液在4°C下均质化约3分钟，然后在4°C下孵育约5分钟。
提示：您可能需要在中途暂停均质化1分钟，以避免样品过热。
4.将悬浮液在4°C下以14,000 - 17,000 g的速度离心5-10分钟，以使不溶性物质沉淀。
5.将上清液转移到新管中，置于冰上。
6.使用Bradford或BCA测定法检测裂解物的蛋白质浓度。
注意：如果此阶段的蛋白质浓度较低，并且蛋白质位于细胞核或线粒体中，则可以考虑分馏原始样品以产生更浓缩的裂解物。
7.将裂解物等体积分装到几个离心管中。
8.用上样缓冲液中稀释等分试样。添加上样缓冲液以稀释等分试样至总蛋白质浓度约为 1-2 mg/mL。
注意：确保上样缓冲液含有 DTT。
提示：在冰箱中储存之前，用上样缓冲液稀释裂解物可使其更加稳定。
9.样品制备完全，可直接用于后续实验，或将样品储存在-80°下直至使用。
二、上样和跑胶
将凝胶浸入缓冲液中，加入蛋白质样本，然后对凝胶施加电流，使蛋白质从凝胶的一端（负极）迁移到另一端（正极）。不同分子量的蛋白质迁移速度不同，较小的蛋白质在凝胶中移动得更快，会出现在更下方，从而实现不同大小蛋白质的分离。
所需材料
- SDS-PAGE凝胶（Tris-甘氨酸、Bis-Tris或Tris 醋酸盐凝胶）
- 凝胶电泳仪
- SDS
- 电泳缓冲液（例如Tris-甘氨酸、MES、MOPS、Tris-Acetate）
实验步骤
1.根据目标蛋白的大小选择合适的 SDS-PAGE 凝胶并设置运行装置。将凝胶放入运行装置中，并用电泳缓冲液填充，以使凝胶完全浸没。
表 1：针对不同蛋白质大小的推荐梯度凝胶化学成分。我们的实验室使用梯度凝胶，但也可以使用固定丙烯酰胺浓度的凝胶。
表 2：不同大小蛋白质适合的分离胶浓度和调用缓冲液推荐。一般10 -15%的分离凝胶是一个很好的起点。
提示：蛋白质越大，凝胶中丙烯酰胺的百分比就越低。这样可以形成密度较低的聚合物，使蛋白质更容易穿过。
注意：跑胶时，确保电泳仪的正极和负极插入正确。
2.解冻裂解物，然后将裂解物在95-100°C下煮沸10分钟。放在冰上冷却。
3.每个样品中取等量的蛋白质上样到凝胶中。
提示：上样量建议，一般裂解物蛋白质10-40 µg，纯化蛋白10-500 ng.
注意：添加样品前请确保孔是直的。
不要使孔超载；这可能会导致样品溢出到相邻的孔中。
同时不要让移液器尖头接触孔底，容易导致带状扭曲。
4.设置运行时间和电压，进行凝胶电泳。
注意：理想的运行时间和电压会因制造商、凝胶成分和目标蛋白质的不同而有所差异。蛋白质越大，则应在更高的电压下运行更长时间。
5 .跑胶结束后，使用凝胶刀小心地撬开装置并取出凝胶。
三、从凝胶转移到膜
电泳后，蛋白质被转移到膜上，用于抗体孵育。该膜可以由硝化纤维素或PVDF制成。
• 半干转印
半干式转印需要额外的设备，但转印时间更短且设置更容易。
所需材料
- SDS-PAGE凝胶
- 转移装置
- 洗涤缓冲液（例如TBST）
- 膜（硝酸纤维素或PVDF）
- 甲醇（如果使用PVDF）
实验步骤
1.如果使用PVDF膜，请将膜浸泡在甲醇中。然后在4°C下放入转移缓冲液中浸泡10分钟。
提示：此步骤对于PVDF膜必不可少，由于 PVDF 具有天然疏水性，因此需要用甲醇活化以使缓冲液有效通过。但对于硝酸纤维素膜则不需要。
2.按照正确的位置将SDS-PAGE凝胶和膜组装到转移盒中。凝胶应该最靠近负极。
而膜应最靠近正极。用小滚筒向下按压纸叠以消除所有气泡。
注意：确保滤纸剪成与膜相同的尺寸。
3.设置运行时间和电压，进行转膜。
4 .从转移装置中取出凝胶和膜。
• 湿转
湿式转印是在槽中进行的。它不需要像半干式转印那样多的额外设备，但转印时间通常较长。
所需材料
- SDS-PAGE凝胶
- 转移装置
- 转移缓冲液（例如 Tris-Glycine）
- 洗涤缓冲液（例如 TBST）
- 膜（硝化纤维素或 PVDF）
- 甲醇（如果使用 PVDF）
实验步骤
1.如果使用PVDF，请将膜浸泡在甲醇中。然后在4°C下放入转移缓冲液中浸泡10分钟。
提示：此步骤对于PVDF膜必不可少，由于PVDF具有天然疏水性，因此需要用甲醇活化以使缓冲液有效通过。但对于硝酸纤维素膜则不需要。
2.按照正确的位置将SDS-PAGE凝胶和膜组装在转移装置中。凝胶应该最靠近负极。该膜应最靠近正极。用小滚筒向下按压纸叠以消除所有气泡。
注意：使用塑料镊子来处理膜。
确保滤纸剪成与膜相同的尺寸。
3.根据需求设置合适的运行时间和电压。
4 .从转移装置中取出凝胶和膜。
四、膜封闭和抗体孵育
使用以下步骤进行抗体孵育。如果在化学发光蛋白质印迹中使用上样对照抗体，则可以在剥离后在同一膜上重复以下染色步骤。
在荧光蛋白质印迹实验中，可按照下列步骤同时将多组抗体与膜一起孵育。上样对照抗体和检测抗体可在同一张膜上运行，无需剥离。
• 对于偶联一抗
所需材料
- 封闭缓冲液（例如：TBST中的3-5%牛奶或 BSA，或非哺乳动物蛋白缓冲液）
- 洗涤缓冲液（例如TBST）
- 膜
- 偶联一抗
实验步骤
1.转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤5分钟。（可选）
2.将膜置于25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
提示：封闭缓冲液中含有牛奶或BSA（TBST 中为 3-5%）。
一般来说，BSA的结果更清晰，因为BSA中与抗体发生交叉反应的蛋白质较少。有些抗体与牛奶配合效果更好，因为牛奶中含有更多种类的阻断蛋白质。
3.用 15ml TBST 洗涤三次，每次5分钟。
4.将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于10 ml一抗稀释缓冲液中，在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动，或在室温下孵育1小时。
注意：确保一抗稀释液完全覆盖膜。孵育时间可能需要根据具体实验进行优化。
5.用15 ml TBST洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。
• 对于无偶联的一抗
所需材料
- 封闭缓冲液（例如：TBST中的3-5%牛奶或BSA，或非哺乳动物蛋白缓冲液）
- 洗涤缓冲液（例如TBST）
- 膜
- 一抗
- 偶联二抗
实验步骤
1.转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤5分钟。（可选）
2.将膜置于25 ml封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
提示：封闭缓冲液中含有牛奶或BSA（TBST 中为 3-5%）。
一般来说，BSA的结果更清晰，因为BSA中与抗体发生交叉反应的蛋白质较少。有些抗体与牛奶配合效果更好，因为牛奶中含有更多种类的阻断蛋白质。
3.用15 ml TBST洗涤三次，每次5分钟。
4.将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于10 ml一抗稀释缓冲液中，在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动，或在室温下孵育1小时。
注意：确保一抗稀释液完全覆盖膜。孵育时间可能需要根据具体实验进行优化。
5.用15 ml TBST洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。
6.加入10 ml封闭缓冲液稀释好的二抗，在室温下轻轻摇动孵育1小时。
7.用15 ml TBST洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。
五、蛋白质检测
在化学发光检测中，第一步是将印迹放入化学发光底物溶液中孵育，这样当存在 HRP偶联抗体时，就会发光。印迹上的这些光带对应于抗体结合。化学发光印迹传统上是使用基于X 射线胶片的技术进行成像的，但这些技术正在被台式电荷耦合器件（CCD）成像仪所取代，后者可以提供更高质量的图像。
具体实验操作，根据购买的仪器和化学发光显色试剂盒的说明进行操作，必要时根据自己的实验需求进行优化。
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